生殖器皰疹到底能不能夠治愈?如果不能治愈的話,對生

      生殖器皰疹是由單純皰疹病毒Ⅰ型、Ⅱ型所致性病之一。近年來發(fā)病率明顯升高。單純皰疹病毒可引起皮膚、粘膜及多種器官感染。它可以通過性接觸感染而發(fā)生生殖器官皰疹。目前生殖器皰疹的流行情況在STD中非常引人注意，它已成為歐美最常見的性病之一。如英國自1971年的4000例增至19８5年的20000例。在美國，1966-1984年已增加了15倍。估計美國人群累計病例超過3000萬。本病占STD中第5位（7.7%）。在歐美國家中占5%-10%，特別是最近由于性行為多樣化，口腔性行為的普遍，生殖器從口腔感染HSV相對增多。另外還有一個背景，即對HSV無免疫，故成人感染增加。HSV-2是生殖器皰疹的主要病原體，90%生殖器皰疹病例是由HSV-2型引起，10%由HSV-1型引起。世界各地HSV-2型患病率顯著增加，臨床所見的生殖器皰疹患者中，年齡最小者16歲（女），最大者為69歲（男），無論男或女均以20-30歲年齡組，發(fā)病率最高，其比率分別是38%（男）和52%（女）。在美國大學生中，HSV-2血清流行率僅2%-4%，而家庭診所就診者則高達25%~30%。在美國總?cè)丝谥薪?0年HSV-2血清流行率增加了1/3，達23%。在發(fā)展中國家，HSV-2血清流行率更高，如烏干達婦女保健診所高達41%，秘魯STD中心為83%。在我國近幾年生殖器皰疹也明顯增加。但發(fā)病率沒有詳細統(tǒng)計。人群中HSV感染較為普遍，人是皰疹病毒的自然宿主。主要傳染源是生殖器皰疹患者和無癥狀的病毒攜帶者。追查男性的傳染源，近半數(shù)歸咎于嫖妓，其他幾乎來自各種類型的不潔性行為的性濫者。生殖器皰疹患者是在與性伴的性接觸中感染上本病的，而這些性伴通常不知道自己已患上了生殖器皰疹。這就是生殖器皰疹廣泛蔓延的原因之一。HSV-1常由飛沫和唾液傳播，而HSV-2幾乎都是性接觸傳播?！静≡瓕W】單純皰疹病毒屬于病毒科，直徑180nm，是較大的DNA病毒。它可以分為HSV-1和HSV-2兩個亞型，它們在生物學、自然屬性以及人類對它們的免疫方面存在著不同。但這兩個亞型感染引起的病理生理卻相同。HSV的核酸結(jié)構(gòu)為雙股線狀DNA，每股DNA分長、短兩個部分。分子量約為100×106道爾頓，15萬鹼基對，可編碼60個以上的基因產(chǎn)物。在DNA病毒中，單純皰疹病毒基因結(jié)構(gòu)具有特殊性，因為它的兩個獨立的核苷酸序列兩側(cè)有倒置的重復序列，這兩個核苷酸序列能夠互相倒置聯(lián)系，病毒DNA有四種異構(gòu)體。HSV-1和HSV-2的病毒基因有50%左右的同源性。HSV病毒形態(tài)呈球形，病毒核衣殼表面是由162個殼微粒組成的對稱20面體（100-110nm），其內(nèi)是由DNA組成的核心，蛋白質(zhì)外殼包繞著病毒基因組，外面有一層脂膜。在衣殼和包膜之間是一種多蛋白組成的被膜。HSV有三類基因，分別為α、β和γ基因。HSV感染神經(jīng)細胞但不造成細胞死亡，病毒在感染細胞內(nèi)處于抑制狀態(tài)，被感染細胞的存活與功能也不受影響，把這一過程稱為潛伏。病毒基因激活后病毒開始復制，有時可形成皰疹性損害，這一過程稱為復發(fā)。潛伏感染神經(jīng)元細胞核內(nèi)有大量的兩種RNA轉(zhuǎn)錄體，它們與稱作ICP-O的直接早期（α）基因產(chǎn)物重疊，這些RNA轉(zhuǎn)錄體按“反義”方向編碼，表示它們可能是β和γ蛋白轉(zhuǎn)錄的抑制因子，當病毒處于潛伏狀態(tài)時，其復活能力也被降低，對病毒潛伏的分子機理的了解可能有助于為預防HSV復發(fā)找到新途徑。【發(fā)病機理】HSV主要經(jīng)過皮膚、粘膜或破損處進入人體內(nèi)，首先在表皮或真皮細胞內(nèi)復制。不論有無臨床癥狀，病毒在局部充分復制后感染感覺神經(jīng)或自主神經(jīng)未稍。病毒沿神經(jīng)軸索進入神經(jīng)節(jié)內(nèi)的神經(jīng)細胞中。動物實驗發(fā)現(xiàn)，從皮膚粘膜接種HSV到神經(jīng)節(jié)內(nèi)的神經(jīng)細胞發(fā)現(xiàn)病毒，大約2天時間，可見其感染速度相當快。HSV-1通常由呼吸道、消化道及皮膚粘膜密切接觸感染。所以HSV-1常潛伏在三叉神經(jīng)根和頸上神經(jīng)節(jié)內(nèi)。故臨床所見主要是顏面部位的皰疹，HSV-2主要因性行為傳播，生殖器接觸而感染，所以HSV-2則常潛伏在骶神經(jīng)節(jié)內(nèi)，故臨床主要表現(xiàn)為生殖器皰疹?；颊哐鍖W均為陽性，可終生有泌尿生殖道HSV間歇性活動。感染最初階段，病毒先在神經(jīng)節(jié)及與之相接觸的神經(jīng)組織內(nèi)復制，然后通過感覺神經(jīng)到達其未稍而使與之相關(guān)的皮膚、粘膜表面發(fā)生皮損。病毒從外周感覺神經(jīng)擴散到皮膚、粘膜，這一情況，可以解釋表皮大面積受感染和遠離原發(fā)部位新病損發(fā)生的原因。原發(fā)性HSV感染病人常有這些特點，而且從遠離接種部位的神經(jīng)組織中發(fā)現(xiàn)病毒。初次發(fā)病臨床癥狀消退后，在神經(jīng)內(nèi)不再分離到感染性病毒。在細胞表面也檢不出病毒蛋白。各種刺激因素，如免疫抑制、勞累、感染、精神創(chuàng)傷以及皮膚神經(jīng)節(jié)創(chuàng)傷等都可引起病毒復活。原發(fā)感染緩解后，神經(jīng)節(jié)中找不到感染的病毒和病毒結(jié)構(gòu)蛋白，潛伏感染神經(jīng)細胞中的病毒基因組和顯性感染不同，前者HSV的DNA是環(huán)狀的，在潛伏感染的小鼠神經(jīng)細胞核內(nèi)和人的三叉神經(jīng)節(jié)中檢出的RNA轉(zhuǎn)錄物中可與編碼早期基因ICPO的區(qū)域雜交，此RNA是編碼ICPO的DNA互補鏈轉(zhuǎn)錄來的。此“反義”RNA可能參與維持神經(jīng)內(nèi)潛伏感染但不參與建立潛伏感染，維持潛伏感染的機制不清楚，似乎潛伏感染的細胞僅有HSV蛋白質(zhì)的部分轉(zhuǎn)錄?！静±砀淖儭勘砥ぜ毎l(fā)生氣球樣變性，其中可見有嗜酸性包涵體。表皮開始為網(wǎng)狀變性形成的多房性水皰，以后聚合為單房性水皰。真皮乳頭層有輕度水腫，有輕重不等炎性細胞浸潤。反應(yīng)嚴重時可有嚴重血管炎表現(xiàn)。一、癥狀HSV感染是一種全身性疾病，病毒經(jīng)呼吸道、口腔、生殖器粘膜或破損皮膚進入人體，可潛于人體正常粘膜、血液、唾液以及局部感覺神經(jīng)節(jié)和多數(shù)器官內(nèi)，幾乎所有的內(nèi)臟和粘膜表皮內(nèi)都可分離到HSV。原發(fā)感染多為隱性，大多無臨床癥狀或呈亞臨床表現(xiàn)，僅有少數(shù)（約1-10%）可以出現(xiàn)臨床癥狀。主要見于免疫功能低下嬰幼兒或嚴重營養(yǎng)不良或有其它感染的兒童，成人罕見。原發(fā)感染消退后，病毒可持續(xù)潛居體內(nèi)。正常人中約有半數(shù)以上為本病毒的攜帶者，可通過口、鼻分泌物而成為傳染源，由于HSV在人體中不產(chǎn)生永久免疫力，故每當機體抗病能力減退時，如患某種發(fā)熱性傳染病，胃腸功能紊亂、月經(jīng)、妊娠、病灶感染、過度疲勞、情緒環(huán)境改變時，體內(nèi)潛伏的HSV即被激發(fā)而發(fā)病。HSV-1主要引起口唇皰疹，咽炎，角膜結(jié)膜炎和散發(fā)性腦炎，而HSV-2感染主要引起生殖器皰疹，但在臨床上也有相反情況。HSV感染的潛伏期為1-45天，平均為6天，HSV-1感染主要發(fā)生于口角、唇緣、鼻孔等皮膚粘膜交界處，亦可見顏面或口唇，開始局部先有灼癢及輕度緊張感，偶有伴發(fā)神經(jīng)痛。隨即出現(xiàn)紅斑，在紅斑基礎(chǔ)上發(fā)生簇集性小丘疹，迅速變?yōu)樗诹Ｖ辆G豆大小的水皰，內(nèi)容澄清，水皰破裂后出現(xiàn)糜爛面，數(shù)日后干燥結(jié)痂。自覺灼癢，偶有倦怠，不適和輕微發(fā)熱等全身癥狀，愈合可遺留暫時性色素沉著。全病程1-2周左右。HSV-2感染主要發(fā)生于生殖器部位，患部先有燒灼感，很快在紅斑的基礎(chǔ)上發(fā)生成群的小水皰，多見男性包皮、龜頭、冠狀溝、陰莖等處，偶見于尿道；女性常見于陰唇、陰蒂、陰道、宮頸等處。水皰可逐漸變成膿皰，約6天左右破潰而形成糜爛或淺的潰瘍，自覺疼痛。病人可發(fā)生尿道炎，出現(xiàn)排尿困難。多數(shù)人有腹股溝淋巴結(jié)腫大疼痛，有的病人可出現(xiàn)發(fā)熱、肌肉痛及腦膜炎癥狀。如發(fā)于女性宮頸者可形成潰瘍壞死，陰道分泌物增多，可有下腹痛。應(yīng)注意有無宮頸癌發(fā)生。孕期患生殖器皰疹時易致流產(chǎn)、早產(chǎn)或死胎，并易使新生兒感染，發(fā)生新生兒單純皰疹。本病一般經(jīng)過3周左右可以痊愈，但常有反復發(fā)作，一般原發(fā)疹后1-4個月內(nèi)復發(fā)，癥狀較原發(fā)者輕，范圍亦小，局限于生殖器部位，有時僅有1-2個皰疹，病程亦短，自發(fā)病至愈合8-12天。本病也可伴有生殖器以外部位的感染，如口唇、臂部及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等。二、體征皮損為紅斑基礎(chǔ)上可見成群的水皰或膿皰或成糜爛及潰瘍。女性患者約90%伴有HSV宮頸炎，宮頸可見發(fā)紅、糜爛、潰瘍，有膿性陰道分泌物。有的患者可有腹股溝淋巴結(jié)腫大壓痛或體溫升高。皮膚病變也可出現(xiàn)在口唇、手指、臀部、大腿、手臂，甚至眼部與咽喉。并發(fā)腦膜炎或橫貫性脊髓炎，一般于發(fā)疹后3-12天出現(xiàn)頸項強直等顱內(nèi)壓增高的現(xiàn)象。三、潛伏感染和復發(fā)HSV感染人體后1周左右，血中出現(xiàn)中和抗體，3-4周達高峰，可持續(xù)多年，這些抗體能清除病毒和使機體康復，但大多數(shù)個體不能徹底消滅病毒，也不能阻止復發(fā)，病毒以潛伏狀態(tài)長期存在宿主體內(nèi)。不同亞型HSV感染者急性首發(fā)生殖器皰疹的臨床過程相似，但生殖器病變復發(fā)率不同，首發(fā)HSV-2感染者約90%，在12個月內(nèi)會出現(xiàn)一次復發(fā)（平均復發(fā)4次），而初次感染HSV-1者僅50%出現(xiàn)類似復發(fā)（平均復發(fā)次數(shù)小于1）。不同個體及同一病人一生中生殖器HSV-2感染的復發(fā)率變化很大，大多數(shù)年復發(fā)5-9次，一般在原發(fā)皰疹消退后1-4個月內(nèi)發(fā)生，有些患者受到促發(fā)因素，如發(fā)熱、月經(jīng)、日曬、寒冷、某些病毒感染等的影響而復發(fā)，其特點是每次復發(fā)往往發(fā)生在同一部位，復發(fā)前可有前驅(qū)癥狀如局部瘙癢，發(fā)疹前數(shù)小時感染部位有灼燒，麻刺感。復發(fā)生殖器皰疹（GH）對患者心理影響較大，由于目前尚無預防復發(fā)的有效療法及可能有誘發(fā)生殖器惡變的危險性，故給患者帶來心理影響，患者多有抑郁、恐懼等心理障礙，這又直接影響HSV的復發(fā)。我們的治療經(jīng)驗，只要患者堅持規(guī)律治療，都能治愈。四、HSV與HIV感染：HSV常與HIV-1同時感染，并能促進病情發(fā)展，引起嚴重的局部和播散性感染。目前認為HSV是一種調(diào)節(jié)因素，能激活HIV復制，Heng對6例AIDS合并生殖系統(tǒng)HSV皮膚損害患者進行皮膚活檢，發(fā)現(xiàn)角化細胞和巨噬細胞均有HIV-1和HSV-1雜交后使HIV-1保留其感染性，而無需與CD4分子結(jié)合即能進入細胞內(nèi)。此外HSV-1能刺激潛伏型HIV-1，而增加HIV-1/HSV-1共同感染和在組織中的復制?！驹\斷】HSV感染的診斷要依據(jù)病史、臨床表現(xiàn)和實驗室檢查結(jié)果而定。有不潔性交史，而且在生殖器部位出現(xiàn)皮膚紅斑和原發(fā)性水皰，易復發(fā)等不難診斷。必要時可作皰液涂片，培養(yǎng)、接種、免疫熒光檢查。血清免疫抗體測定等，均有助于診斷和確定病毒類型。一、細胞學方法對皮損刮片做Wright-Gemsa（Tzanck試驗）或Papanicolaou染色，可檢出HSV感染特征的巨細胞包函體，但不能區(qū)別HSV感染或水痘—帶狀皰疹病毒感染，敏感性僅為病毒分離的60%。二、培養(yǎng)法從水皰底部取材做組織培養(yǎng)分離病毒，為目前較敏感、最特異的檢查方法，需5-10天，因其技術(shù)條件要求高，價格昂貴，不能普遍使用。三、抗體檢測目前最廣泛的是HSV-2抗體檢測，如蛋白印跡法也可用gD2作抗原檢測HSV-2抗體，具有敏感性，且能區(qū)分HSV-1和HSV-2的優(yōu)點。四、基因診斷（一）用PCR分型檢測單純皰疹病毒PCR是一種敏感性高，特異性強的快速檢測方法，標本中含有1fgHSV-DNA就可以檢出，其在HSV感染的診斷研究中發(fā)展較快，且分型檢測HSV是發(fā)展的趨勢。1、標本采集和處理（1）標本采集①腦脊液：直接無菌采取患者0.5ml腦脊液標本于無菌試管送檢.如肉眼可見血色,應(yīng)離心取上清。②羊水及嬰兒血清：同上,應(yīng)避免溶血.③腦組織：腦組織尸檢、活檢標本,加1mlPBS標本緩沖液研磨后，待檢。④眼及皮膚病灶分泌物：用預測（半干）棉拭子直接取患處分泌物，置1mlPBS標本緩沖液中送檢。⑤生殖器（宮頸、陰道、外陰、陰莖）標本：先用消毒棉拭子擦去病變部位表面粘液、污垢，再用預潮棉拭子用力擦拭患處分泌物，置1mlPBS標本緩沖液中送檢。（2）標本處理①預處理：所有液體標本均可直接進行模板制備；可以取100μl標本液，離心5000r/min×5min后，去上清，取沉淀物進行模板制備。②模板制備：a：蛋白酶K消化裂解法：沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液，55℃1h后，煮沸10min，離心5000r/min×5min，收集上清。b：水煮法：沉淀物加100μl蒸餾水，搖均水煮20min，離心5000r/min×5min收集上清。c：1%TritonX-100裂解法：取采集的標本液100μl，加入1μlTritonX-100，水煮20min，5000r/min×5min，收集上清。d：5%NP-40裂解法：取采集的標本液100μl，加5μlNP-40，水煮20min，5000r/min×5min收集上清。e：如標本溶血嚴重經(jīng)上述裂解處理后，再加等體積酚-氯仿抽提、冷乙醇沉淀DNA，加10μlDW溶解待檢。2、PCR擴增（1）引物設(shè)計。以HSVDNA聚合酶的高保守區(qū)為檢測靶序列以確保特異性。設(shè)計3個引物，一個上游共同性引物，DNAP5（5′ATGGTGAAAACATCGACATGTACGG3′）：二個下游特異性引物，DNAP3-1（5′CCTCGCGTTCGTCCTCGTCCTCC3′）和DNAP3-2（5′CCTCCTTGTCGAGGCCCCGAAAC3′），可以分別擴增出HSV-1469bpDNA片段（1981～2359）、HSV-2391bp片段（1561～1953）：從二型PCR擴增產(chǎn)物中設(shè)計了一個不分型的特異性探針HSVP35"GGCGTAGTAGGCGGGGATGTCGCG3"）。（2）PCR實驗體系。取模板10μl：DNAP50.5（0.2μmol/L）：DNAP3-10.5μl(0.2μmol/L)：DNAP3-20.5μl(0.2μmol/L)：4×dNTP8μl(4×200μmol/L)：10×dNTP8μl(4×200μmol/L)；10×緩沖液10μl：DMSO4μl；加DW65.5μl；石蠟油30μl.。水煮（96℃～100℃）7min加TaqDNA聚合酶1μl；（2.5U）72℃4min↓95℃40s↓65℃60s→72℃70s↓33個循環(huán)70℃4min3．擴增產(chǎn)物的檢測和分析（1）瓊脂糖凝膠電泳染色法：取擴增產(chǎn)物20μl加樣品緩沖液4μl混勻后，點樣于2%瓊脂糖凝膠板，70V電泳15～20min，溴化乙錠（EB）染色5min，于紫外燈下觀察結(jié)果在溴酚藍后面有一條或二條亮紅帶為陽性結(jié)果，HSV-2帶在前，HSV-1帶在后，無帶則為陰性結(jié)果。（2）XhoI酶譜法：取HSV-1型PCR產(chǎn)物50μl加XhoI50U，37℃1h后，置3%瓊脂糖凝膠中，70V電泳15～20min，可產(chǎn)生46bp片段帶（引物后面）；與正常PCR產(chǎn)物比較，XhoI酶切后的大片段電泳位置前移。（3）Southern印跡法：PCR產(chǎn)物20μl經(jīng)電泳分離后，用變性液處理60min，再用中和液處理90min，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上：80℃烤膜2h，42℃預雜交（雜交液中）30min，加入32p標記HSVP3探針后,42℃雜交過夜；次日用1%SDS/PBSpH7.2,42℃洗15min，0.5%SDS/PBSpH7.2,42℃洗15min;膜置X線暗盒內(nèi)放射性自顯影12～15h,顯影為陽性,不顯影為陰性。（二）套式PCR套式PCR（nestedprimers-polymerasechainreaction，NP-PCR）是通過“外側(cè)”、“內(nèi)側(cè)”兩對引物，即一對擴增較大DNA片段的“外側(cè)”引物和一對位于擴增產(chǎn)物中再擴增小片段的“內(nèi)側(cè)”引物，這樣兩次連續(xù)放大可以提高PCR檢測的靈敏度，保證產(chǎn)物的特異性。但該方法不能分型，能100%檢出HSV-1，50%檢出HSV-2，應(yīng)改進分型檢測HSV，更好地在臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究中推廣應(yīng)用。1、標本處理：（1）標本采集同上（2）DNA制備：①腦脊液：取100μlCSF水煮15min,加入250μl無水乙醇，放-30℃10min；離心10000g30min，去上清，30℃干燥后，加入10μlDW；②腦組織細胞：取沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液，56℃作用1h，水煮10min；取上清加入等體積酚一氯仿（V/V），輕搖10min，離心10000r/min×10min;取水相，加入250μlDW溶解。2、PCR擴增(1)引物設(shè)計：選擇HSV1糖蛋白D基因為檢測靶基因。(2)PCR實驗體系和程序：反應(yīng)體積為50μl；模板10μl；BJHSV1.10.5μl(0.2pmol/L)；BJHSV1.20.5μl(0.2pmol/L)；10×緩沖液5μl；4×dNTP4μl(4×200mmol/L)；DW27μl;石蠟油30μl。循環(huán)參數(shù)為95℃30s;55℃30s;72℃60s;循環(huán)20次,取其擴增產(chǎn)物1μl加入含有BJHSV1.3和BJHSV1.4反應(yīng)體系中進行套式擴增,先95℃變性2min，循環(huán)參數(shù)為95℃30s;55℃30s;72℃60s;循環(huán)30次后，72℃延伸5min;。(3)擴增產(chǎn)物分析：①瓊脂糖凝膠電泳染色法：取擴增產(chǎn)物10μl點樣于2%瓊脂糖凝膠中，70V電泳15-20min,溴化乙錠染色5min，于紫外燈下觀察結(jié)果,在溴酚蘭后面有一條，或二條亮紅條帶為陽性結(jié)果,HSV-2帶在前，HSV-1帶在后，無帶則為陰性結(jié)果。②Southern印跡法：PCR產(chǎn)物20μl經(jīng)電泳分離后，用變性液處理60min，再用中和液處理90min，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，80℃烤膜2h，42℃預雜交（雜交液中）30min，加入32P標記HSV探針后，42℃雜交過夜，次日用1%SDS/PBSpH7。2，42℃洗15min，0.5%SDS/PBSpH7.2，42℃洗15min；膜置X線暗盒內(nèi)，放射性自顯影12-15h，，顯影為陽性，不顯影為陰性。（三）、聚合酶鏈反應(yīng)—酶譜法（polymerasechainreaction-endonucleasecleavagePCR-EC）具有經(jīng)濟廣泛等特點；不僅能一次性分型檢測HSV-1，HSV-2，EBV，CMV四種病毒，而且方法本身快速、方便、無放射線損傷，易被實驗室接受?？蓹z出3個CFU的HSV1，靈敏度高，能檢測出中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染第1dCSF中HSVDNA陽性結(jié)果，并可用于藥物治療效果的評價。由于病毒的變異性，會出現(xiàn)酶切點突變丟失現(xiàn)象，從而造成酶切陰性結(jié)果。對此可以通過型特異性探針或序列分析解決。1.標本處理（1）標本采集，方法同上。（2）DNA模板制備：每份標本取200μl，按200μg/ml加入蛋白酶k，56℃作用1h；加入等體積的酚—氯仿（v/v）輕搖10min，離心1000r/min×5min；取水相加入500μl(2.5倍體積)無水乙醇，-20℃過夜沉淀DNA，離心15000r/min×5min,吸去液體，30℃干燥后,加蒸餾水25μl溶解,待檢。2.引物設(shè)計：P1，5′CGACTTTGCCAGCCTGTACC3′P2，5′AGTCCGTGTCCCCGTAGATG3′（1）PCR實驗體系：反應(yīng)體積100μl；模板10μl;P10.5μl(10pmol/L)，P20.5μl(10pmol/L);4×dNTP4μl(4×200mmol/L);10×緩沖液10μl,DMSD5μl,DW65μl,循環(huán)參數(shù)為94℃60s;60℃60s;72℃60s；循環(huán)40次72℃延伸4min。（2）擴增產(chǎn)物檢測與酶切分型.①第一步電泳鑒定：取10μlPCR產(chǎn)物加4μl樣品緩沖液,加入2%瓊脂糖凝膠板,70V電泳(5-20min)加EB染色5min后,紫外燈下觀察,可初步鑒定擴增產(chǎn)物大小。②酶切分析：分別取20μlPCR產(chǎn)物于2個Eppendf管中，加入50μl無水乙醇，-20℃沉淀DNA，再分別用20μlSmal和BamHI反應(yīng)緩沖液溶解，加入SmaI或BamHI50U于相應(yīng)Eppendf管內(nèi)，37℃作用1h。③第二步電泳分型，取10μlPCR酶切物加4μl樣品緩沖液，加到2%瓊脂糖凝膠中,70V電泳,15-20min后,EB染色5min,與同步加入未酶切的PCR產(chǎn)物相對照。（四）用RT-PCR檢測單純皰疹病毒RNA的聚合酶鏈反應(yīng)（RNA-PCR），可能通過檢測HSV不同期的RNA，這不僅可診斷HSV感染，而且有利于HSV的潛伏期感染機制的深入研究。RT-PCR是以RNA為模板經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（RT）產(chǎn)生cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增以達到檢測目的。因此，RNA-PCR也可稱為RT-PCR。1、標本處理：組織塊細胞總RNA提取，取100mg組織標本，加1ml硫氰酸胍變性液，于勻漿器中，室溫研磨均勻后，移入2.5mlEppendf管中。依次加入0.1ml3mol/L(pH4.0)NaAc,1ml水飽和酚和0.2ml氯仿一異戊醇混勻,用力振搖10s,置冰浴15min。10000g4℃,離心20min,取上清水相(上層DNA、下層DNA和變性蛋白質(zhì))加入等體積異丙醇置-20℃1h,沉淀RNA。離心15000r/min×10min,棄上清,RNA重新用0.3ml硫氰酸胍變性液溶解,再加0.3ml異丙醇沉淀,-20℃1h,沉淀RNA.離心15000r/min×10min,去上清,沉淀RNA用75%冷乙醇洗一次,真空干燥。.加10μlTE緩沖液（pH7.4）溶解,低溫保存?zhèn)溆?臨用前冰浴溶解。2、PCR擴增：（1）引物設(shè)計：選擇HSV-1ICPO基因(極早期)為檢測靶基因.設(shè)計2個引物，P15′GGATCCTCACGTGGTTACCCGCGGTCT3′P25′AAGCTTCCGGGGCCGTCCCCGCGGGCG3′可以擴增ICPO中266bp序列。1個探針：5′CCGGCTGGAGCCGCCGCACCCTGCT3′。（2）PCR實驗體系：總反應(yīng)體積為50μl，模板10μl（0.25-1.0μg）P11μl(20pmol/L)；P21μl(20pmol/L);4×dNTP4μl（200μmol/L)；10×緩沖液5μl；AMV(逆轉(zhuǎn)錄酶)2μl(50U)；DW26μl；循環(huán)參數(shù),94℃變性2min后94℃50s，60℃60,72℃60s，循環(huán)40次后72℃延伸5min。3、擴增產(chǎn)物的鑒定：（1）瓊脂糖凝膠電泳染色法：取10μlPCR擴增產(chǎn)物加4μl樣品緩沖液，混勻后加樣2%瓊脂糖凝膠板，70V電泳15-20min，EB染色5min。紫外燈下觀察擴增條帶。（2）Southern印跡雜交法：用32P標記的特異性探針檢測PCR產(chǎn)物，方法同上。總之，在HSV感染性疾病的臨床診斷中，PCR能對前病毒或潛伏期低復制的HSV特異性靶DNA片段進行擴增檢測，遠較DNA探針敏感，并能在血清中抗體出現(xiàn)前就可以檢出。因此，PCR無論是作為基礎(chǔ)研究手段，還是作為臨床檢驗診斷方法，均具有廣闊的前景。五、病理組織學診斷細胞內(nèi)水腫，基底層形成大水皰，病灶周圍有多核巨細胞浸潤，特別是多核白細胞與淋巴細胞充斥于病灶中間?！捐b別診斷】主要與硬下疳，軟下疳鑒別：硬下疳為單個質(zhì)硬的潰瘍，無疼痛感，無復發(fā)史，實驗檢查USR（+）或RPR（+），梅毒螺旋體可見。軟下疳為質(zhì)軟的潰瘍，局部雖有疼痛感但無復發(fā)史，實驗檢查鏈桿菌陽性。其他生殖器部位皮膚病如接觸性帶狀皰疹、白塞病。膿皰病有時與生殖器皰疹相似，可以從病史及檢查方面相區(qū)別。本病有自限性，約1-2周即可自愈。治療的目的是防止下次復發(fā)。本病目前尚無特效藥物，治療原則為縮短病程，防止繼發(fā)感染，減少復發(fā)。1．局部療法：原則為干燥、收斂、保護患部，防止繼發(fā)感染。可外涂2%龍膽紫溶液，或選用10%次沒食子酸鉍（代馬妥dermatol）、氧化鋅油膏或泥膏、紫草生地榆油膏、0.5%新霉素軟膏、或0.25%~0.1%皰疹凈（IDU）軟膏、5%皰疹凈二甲基亞砜溶液（用于皮膚皰疹）等。對顏面部者亦可用10%醋酸鋁或鋅銅合劑。2．全身治療：治療原則其一使感染的HSV不能活化，甚至消滅病毒；其二調(diào)節(jié)免疫，防止再發(fā)，可用阿昔洛韋靜滴或口服，麗珠威口服，干擾素肌注，白細胞介素Ⅱ肌注。我們在治療復發(fā)性生殖器皰疹時，使用四醫(yī)大生物技術(shù)中心產(chǎn)的干擾素300萬單位肌注，每日一次，10次為一療程，共三個療程，適當配合使用白細胞介素Ⅱ或利百多或靈桿菌素，95%的病人不復發(fā)。下面介紹別人治療皰疹方法供參考：一、抗HSV藥物（一）無環(huán)烏苷是公認的有效藥物：1．原發(fā)和初發(fā)感染：ACV200mg，每日5次，連服7天；或ACV5mg/kg，按體重靜注，8小時一次，連續(xù)5-7天。2．復發(fā)感染時，ACV200mg，每日5次，連服5天，或ACV800mg，每日2次，連服5天；若在剛開始出現(xiàn)前驅(qū)癥狀時或在損害出現(xiàn)后的2天內(nèi)即開始治療，則對部分患者可能有效3．復發(fā)頻繁時：ACV200mg，每日3次，可連續(xù)服用6-12個月。在經(jīng)常復發(fā)的患者中（每年＞6次），每日治療至少可以減少75%的復發(fā)次數(shù)，在接受長達3年治療的人群，已確定是安全有效的。從接受治療的人群中已分離到耐ACV的HSV株，但免疫功能正常者未見治療失敗者。治療1年后應(yīng)停藥，以便重新評價患者的復發(fā)率。4．免疫受抑制患者：首發(fā)或復發(fā)的急性患者：靜注ACV（5mg/kg/8h）或口服ACV400mg×4次/日，共7-10天；抑制復發(fā)：每天靜注ACV（5mg/kg/8h）或口服ACV（400mg×3-5次/天），可預防復發(fā)。5．HSV直腸炎，ACV400mg，每日5次，可縮短病程。免疫受抑制或重癥者可靜注ACV5mg/kg/8h。6．新生兒HSV：現(xiàn)有資料認為，不應(yīng)該常規(guī)應(yīng)用ACV治療通過產(chǎn)道感染的無癥狀嬰兒，治療僅限于有HSV臨床表現(xiàn)及產(chǎn)后病毒培養(yǎng)陽性的患兒。所有新生兒HSV感染者應(yīng)接受ACV或阿糖腺苷治療。常采用ACV300mg/kg/d，阿糖腺苷30mg/kg/d，靜脈注射共10-14天。7．合并HIV感染：患者需口服ACV間歇或每日抑制治療。對合并HIV感染者增加ACV劑量是十分有益的。ACV400mg，口服，每日3-5次，治療有效，應(yīng)持續(xù)用藥直至臨床癥狀消失；對重癥者，應(yīng)用ACV靜脈給藥，對可疑或已證實的ACV耐藥株引起的重癥患者，最佳方案可能是：ACV400mg/kg，靜脈注射，每8小時一次，直至臨床痊愈。HIV感染者中的皮膚損傷粘膜HSV感染時大劑量ACV治療無反應(yīng)者日益增多。大劑量ACV對部分患者有助于損傷的愈合，但不能阻止另外一些患者的病情進展。對復發(fā)頻繁者長期服用ACV不能制止繼續(xù)排毒，因此，仍可對性伴感染，此時若改用作用機理不同的抗病毒藥物如磷甲酸和阿糖腺苷等可能有效。ACV的抗病毒機理是它很容易被HSV編碼的胸苷激酶磷酸化，形成ACV-MP，再被細胞激酶作用而形成ACV-TP。ACV-TP與dGTP競爭而抑制病毒DNA合成。ACV全身應(yīng)用治療首次臨床發(fā)作或作為抑制治療藥物時，可使皰疹發(fā)作的癥狀和體征得到控制。然而，該藥既不能根除潛伏病毒感染，也不能影響以后發(fā)作的次數(shù)和嚴重性。該藥局部治療的效果比口服差，故不提倡局部用藥。ACV可縮短生殖器皰疹病程，加速愈合及緩解癥狀，長期應(yīng)用可減少復發(fā)，曾有人對11000例免疫正常的GH連續(xù)治療5年，在此期間復發(fā)率明顯降低。但是長期口服ACV不能清除骶神經(jīng)節(jié)的潛伏病毒，停藥后生殖器皰疹仍可復發(fā)，對ACV有耐藥性的病毒株越來越多，幾乎所有耐藥性都發(fā)生于曾經(jīng)進行多個病程治療的免疫受損害者。ACV靜脈應(yīng)用的主要副作用是由于藥物在腎實質(zhì)內(nèi)結(jié)晶而引起的暫時性腎功能不全。若緩慢給藥一小時以上或大量飲水則可避免此副作用。（二）、病毒唑（三氮唑核苷，RibavinRBV）：抑制病毒多種DNA及RNA復制，合成。用量：原發(fā)GH及AIDS合并HSV感染，15mg/kg/d，肌注；復發(fā)GH，0.4g,口服,每日4次,3天后改為0.4g,每日2次,共5天,療效肯定,用于耐藥病毒株。（三）、磷甲酸（TrisodiumPhosphonofmate，PFA）；選擇性抑制皰疹病毒誘導的DNA依賴的DNA聚合酶，主要用于耐ACV病毒株的感染。用量：40-60mg/kg/d，靜脈注射，每8小時1次，連用4次，可用于AIDS合并HSV感染。外用0.3%-1%PFA霜。副使用有腎毒性及鈣磷代謝紊亂。（四）、雙羥丙氧甲基烏苷（更昔洛韋，Ganciclovir，DNPG）：是ACV的衍生物，通過抑制病毒DNA復制，導致RNA合成受阻，感染細胞DNA多聚酶是作用的靶部位。用量：5-10mg/kg/d，分3次靜注，連續(xù)14天，副作用有造血系統(tǒng)抑制及肝損害。（五）、氟阿糖碘胞苷（FIAC）：對HSV-1和HSV-2有同樣作用，選擇性作用于被病毒感染的細胞，其代謝產(chǎn)物5-碘尿嘧啶、5-甲尿嘧啶均有抗病毒作用。阿糖腺苷磷酸抑制病毒DNA合成，有廣譜抗病毒活性，副使用少，不能防止?jié)摲腥镜慕?，但防止病毒進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)有一定保護作用。抗HSV單克隆抗體局部外用，對GH有治療作用，國外有人報道治療HSV-2總有效率92.6%，基本治愈率44.1%。（六）、消炎痛（Indomethacin）：作用為抑制前列腺素合成，有助于減少GH的復發(fā)，促進conA及PHA（植物血凝素）刺激所發(fā)生的細胞增殖作用，加強NK細胞的殺傷能力，可用于復發(fā)GH的治療，用量：25mg口服，每日3次。（七）、聚肌胞（PolyZIC）：是人工合成的干擾素誘導劑，能刺激吞噬作用，增強抗體形成，對免疫系統(tǒng)起調(diào)節(jié)使用。用量2mg，肌注，2-3次/周。二、對妊娠GH的處理對孕婦使用無環(huán)鳥苷的安全性尚未肯定，但研究發(fā)現(xiàn)，用ACV的孕婦畸胎發(fā)生率與正常人相比，并無增高，但ACV對妊娠及胎兒的危險性尚未得出可靠結(jié)論。對威脅母親生命的HSV感染，如腦炎，肺炎及肝炎，應(yīng)采用ACV靜脈用藥，但無威脅生命的HSV感染，不必全身用ACV治療。依照美國傳染病學會建議，對妊娠期反復發(fā)作的GH處理方案如下：（一）分娩時如無活動性生殖器損害，則無需剖腹產(chǎn)；（二）妊娠未3個月，癥狀性復發(fā)是短暫的，只要分娩時無活動性損害，可經(jīng)陰道分娩。（三）臨產(chǎn)時有活動GH者，可作如下處理：①羊膜未破，孕婦不發(fā)熱，胎兒尚未成熟，應(yīng)延緩分娩；②如系足月妊娠，羊水已破，胎兒肺已成熟，應(yīng)行剖腹產(chǎn)。（一）避免不潔性交及不正當?shù)男躁P(guān)系，活動性生殖器瘡疹患者絕對禁止與任何人發(fā)生性關(guān)系；（二）治療期間禁行房事，必要時配偶亦要進行檢查；（三）對局部損害的護理，應(yīng)注意保持清潔和干燥，防止繼發(fā)感染；（四）治愈后或有復發(fā)者，要注意預防感冒，受涼，勞累等誘發(fā)因素，以減少復發(fā)。目前尚無特異性預防方法，動物實驗表明，接種HSV死疫苗或減毒活疫苗，均有免疫效果，因此病毒與某些癌癥的關(guān)系密切，故不作常規(guī)預防使用。最近用純化的皰疹病毒包膜糖蛋白作疫苗，可避免皰疹病毒DNA的致癌危險性。ACV也有預防作用。陰莖套可能減少疾病的傳播，尤其是在無癥狀排毒期，但出現(xiàn)生殖器損害時，使用陰莖套也不能避免傳播。